Toxikologische Pathologie, Knochenmark-Differential-Zellzahl.

Toxikologische Pathologie, Knochenmark-Differential-Zellzahl.

Toxikologische Pathologie, Knochenmark-Differential-Zellzahl.

  1. Gregory S. Travlos
  1. Labor für Experimentelle Pathologie, National Institute of Environmental Health Sciences, National Institutes of Health, Research Triangle Park, North Carolina 27709, USA
  1. Korrespondenzadresse: Gregory S. Travlos, Labor für Experimentelle Pathologie, NIEHS / NIH, 111 Alexander Dr. MD B3-06, Research Triangle Park, NC 27709, USA; e-mail: travlos@niehs.nih.gov

abstrakt

Knochenmarkgewebe Architektur was sonst Informationen Gesetz über die Informationen zu möglichen behandlungsbedingten Effekte reflektiert im peripheren Blut, Morphologische beurteilung von Knochenmarkzytologie und Paraffinschnitten zur verfügung Stellt Während ein Komplettes Blutbild liefert allein Durch Untersuchung der peripheren Würde verpasst Blut sterben. In entkalkt, in Paraffin Eingebettet, Hämatoxylin und Eosin (H&E) färbten abschnitte des Knochenmarks, reifere Stadien der erythroiden und myeloischen Zellen, Adipozyten, Mastzellen und Megakaryozyten identifiziert Werden Können, Aber lymphatischen Zellen Eulen unreife Vorläuferzellen nicht zuverlässig identifiziert Werden sterben. Die Qualität der Markabschnitte Wird von zahlreichen Variablen im zusammenhang geregelt erfassung und Verarbeitung zu Probe und Durcheinander berücksichtigt Werden. In addition to den Normalen Struktur diskutieren, Funktion und Histologie von Knochenmark, Methoden zur herstellung und Bewertung des Knochenmarks Werden Vorgestellt.

Introduction

Blut und Knochenmark ist Eines der Grössten Organe im Körper und ist ein potenzielles Wichtiges Zielorgan der Chemischen Exposition (Lund, 2000). So Wurde zum beispiel vorgeschlagen, Dass der Drogen Blutdyskrasien repräsentiert 10% aller Blutdyskrasien in Schweden berichtet, und 40% der Befragten in Verhängnis führte (Bottinger und Wester, 1973). Da wirkungen Einer verbindung Kann in der zirkulierenden Blutzellmasse oder der Produktion von Blutzellen, Auswertungen von Einzel- oder Serienvollblut-Proben und schmiert ausgelöst Werden, Knochenmarkaspirate und Gewebeschnitte Mark nötig Sind, um sterben Veränderungen in der leukon zu verstehen, Erythrons oder thrombon, sterben in Studien zur Toxizität auftreten Kann. Examples für Blut- und Knochenmarkstoxizität Kann in Tabelle 1 zu FINDEN.

Examples für chemische Mittel verursacht toxikologischen wirkungen im Knochenmark und / oder Blut.

Die beurteilung von Blut und Knochenmark gerechnet wurden bei der Untersuchung von hämatologischen Erkrankungen im Bereich der Toxikologie und Sicherheitsbewertung Studien Routineverfahren geworden. Auswertung von Blut Würde ausführlich beschrieben (Jain, 1986a; Perkins, 1999; Ryan, 2001). Der Schwerpunkt of this article Wird Auch Eine Auswertung des Knochenmarks mit den Zielen der Überprüfung Einiger Konzepte in BEZUG auf sterben Knochenmark Struktur und Funktion und Überprüfung der qualitativen und quantitativen Bewertungsmethoden Knochenmark. Eine Überprüfung der Verschiedenen Läsionen des Knochenmarks in Labor-Ratten, Mäuse und Hunde Werden in Einer anschließenden Diskussion (Travlos, 2006) präsentiert Werden.

Bone Marrow Struktur und Funktion

Das Knochenmark Wird in den Zentralen Hohlräume axial und Langen Knochen (Abbildung 1). Es Besteht aus hämatopoetischen Gewebe Inseln und Fettgewebe Durch vaskuläre Höhlen Innerhalb Eines Geflechts von trabekulären Knochen Dazwischen umgeben Zellen. Auf sie entfallen rund 3% des Körpergewichts bei erwachsenen Ratten (Schermer, 1967),

5% in Menschen (Picker und Siegelman, 1999). Das Knochenmark ist sterben Wichtigste hämatopoetischen Organ und Einems primären lymphatischen Gewebe, Verantwortlich für sterben Produktion von Erythrozyten, Granulozyten, Monozyten, Lymphozyten und Blutplättchen. Eine kurze Diskussion der Knochenmark Struktur und Funktion Werden hier präsentiert; Ausführliche Descriptions Konnen ein Anderer Stelle (Wickramasinghe, 1992;. Picker und Siegelman, 1999; Hoffman et al 2000 ;. Abboud und Lichtman 2001 Jain, 1986b Weiss und Geduldig, 1991) gefunden.

Repräsentative examples für Knochenmark Zellularität in Langen und axialen Knochen von Normalen erwachsenen B6C3F1-Mausen. Die Markräume Enthalten Inseln und Cluster von hämatopoetischen mit Adipozyten Versetzt Zellen. (A) Distal Oberschenkels. (B) Sternum. (C) Wirbels.

Die Innenfläche der Knochenhöhlen und der Außenfläche des spongiösen Knochenspuren Innerhalb der Hohlräume Werden von Einems endostalen Auskleidung bedeckt sterben Aus einer einzigen schicht von Flächen «Knochen-Futter-Zellen» durch Eine Dünne schicht von retikulären Bindegewebes Unterstützt; Osteoblasten und Osteoklasten Sind Auch Innerhalb des endostalen Auskleidung (Abbildung 2).

Schema des distalen medialen metaphysären femoralis hämatopoetische murine Mark IL-1α-aktiviert. Trabekulären Knochen (Leiter Endet ein Einems canaliculus Erweiterungen Eines osteocyte Enthält) Durch Eine Komplexe SCHICHT aus unterschiedlichen Zellen Eingeschlossen. Osteoblasten (osteobl) und Einems Osteoklasten (osteocl), flach, einfach oder zweilagigen nicht aktivierten Knochen Futter-Zellen (BLC) vorhanden Sind. Retikulumzellen Zweigs von der Öberfläche des Knochens Auf die Adventitia-OBERFLÄCHE von vaskulären Nebenhöhlen (Sinus 2). Barrierezellen bedecken Zwei Stellen auf der oberfläche des Knochens, und en bloc in das Mark verlängern. Die Barrierezellen aktiviert, Organellen assoziiert mit intensiven Proteinsynthese und Sekretion anzeigt. Aus dem abhängigen Aspekt des Knochens, massierten Barrierezellen in Einems Halb fegen, tief in das Knochenmark. Die Sichel des Barrierezellen Hält viele hämatopoetischen Zellen, insbesondere vermeintlichen Stammzellen und Differenzierung megakaryoctes. Am Rand der Mondsichel, Barrierezellen verzweigen Sich in sterben umliegenden Treffen hämatopoetischen Zellen mit eher verlieren angeordnet, reich verzweigte Barrierezellen Liegen unter und hämatopoetischen Zellen zu unterstützen. Barrierezellen, insbesondere in hämatopoetische Zonen sehr Frühen Stadien Enthält Differenzierung Kann lange, schlanke Prozesse und between um Endothel und adventitiellen Tuniken einschleichen. Die Blut-Mark Barriere Wird Characterized VERSTÄRKT, behindert Auswanderung und Einwanderung Zellen des zirkulierenden, vorzeitige Freisetzung von unreifen hämatopoetischen Zellen in den Kreislauf zu verhindern. Im gegensatz dazu Profil von Gefäß- Sinus (Sinus 3) Kann Vollständig Aus einer einfachen SCHICHT aus Sperr Zellen außer an der Perikaryon gestreckt Ziemlich dünn, Hergestellt Werden. This Liegen in hämatopoetischen Zonen Spaten Differenzierungsformen für sterben Auslieferung eine den Kreislauf Enthält, Derens Wand mit Blutzellen gefüllten Öffnungen bedrängt. Sie sind strukturell zu erleichtern Lieferung von Blutzellen in den Kreislauf geeignet. Von: Weiss, L. und Geduldig, U. Barrier Zellen: Stromatumoren Verordnung der Hämatopoese und Blutzellfreisetzung in Normalen und betonte, Mäuseknochenmark. Blut 1991; 78: 975-990. Urheberrecht American Society of Hematology, used mit genehmigung.

In Langen Knochen, ein Mehrere andere Nährstoff Kanäle (mit Einer Nährstoff Arterie und 1 oder 2 Nährstoff Venn) der kortikalen Knochen passieren schräg sterben Markhöhle eintritt. In FlächEn Knochen Wird das Knochenmark Durch zahlreiche Blutgefäße in Verschiedenen Größen Eingabe der Mark über große und kleine Nährstoff Kanäle bedient. Nach Eingabe TEILT Sich sterben Arterie in sterben aufsteigenden und absteigenden Zweige, sterben parallel zu der Langen Achse in DM Zentralen Teil der Markhöhle laufen, um sterben Primär venose Mark Kanal aufwickeln der zentrale Längs Vene (Abbildung 3). This Arterie Zweige Fuhren zu Einer vielzahl von kleinen dünnwandigen Arteriolen (Abbildung 4) und Kapillaren, sterben nach außen in RICHTUNG der kortikalen Knochen verlängern. In der Nähe der Knochen, öffnen Sie Arteriolen und mit Einems Geflecht von venösen Sinus anastomosieren sterben. This venösen Sinus entwässern über Venolen sammeln, zentral zur Längsmittel Vene zurückführen sterben, sterben Dann über Nährstoff Venen entleert sterben. Das Mark Hut Eine Umfangreiche Blutversorgung (Abbildung 5). Auch Scheint es, sterben Dass Nährstoff Arterie abgeleitete Kapillaren in sterben Havers-Kanäle erweitern, Rückkehr in sterben Markhöhle öffnen Sie Dann in Würfel venösen Sinus. SOMIT is also Eine kreisförmige Muster, um den Blutfluss Innerhalb der Markhöhle, von der Mitte der Markhöhle Gegenüber DM umfang des Markhöhle Dann zurück in RICHTUNG der Mitte. In Langen und Flächen Knochen Werden sterben Blutversorgung des Knochens und des Knochenmarks Durch enossalem Netzwerk von Gefäßen Verbunden Sind. Die venösen Sinus Sind dünnwandige, bestehend Aus einer SCHICHT von FlächEn Endothelzellen mit wenig bis gar keine Basalmembran. Das Mark has no Lymphdrainage (Munka und Gregor, 1965).

Der Querschnitt (A) und im Längsschnitt (B) aus dem Femur Eines Männlichen B6C3F1 Steuerung von Einem 28-Tage-Toxizitätsstudie zeigt ein zellulares reichen Knochenmark. Der Pfeil zeigt sterben zentrale Vene, und sterben Pfeilspitzen identifizieren Vertreter venösen Sinus. Der Stern in 3A identifiziert Eine Fläche von Schrumpfung Artefakt with the histologischen Bearbeitung des Knochens Verbunden. CB = kortikalen Knochen.

Diagrammatische Darstellung der Gefäßversorgung des Knochenmarks. Übernommen aus: Abboud, C. N. und Lichtman, M. A. (2001) Struktur des Mark und das Mikroumgebung hämatopoetische. In Williams Hematology, 6. Auflage. Urheberrecht McGraw-Hill, mit freundlicher genehmigung used. Adaptive Zeichnung von David Sabio. 6.-Darstellung der Reifung Verlauf der Mehrere Zelllinien, in DM Knochenmark sterben. CFU = koloniebildende Einheit; E = erythyroid; Meg = Megakaryozyten; Gemm = granulocytic, erythyroid, Monozyten-Makrophagen und Megakaryozyten; GM = Granulozyten / Monozyten; G = Granulozyten; M = Monozyten; Eo = eosinophile; Baso = basophilen; L = Lymphozyten. Zeichnung von David Sabio.

Die Knochenmark Innervation Tritt Mit myelinated und nicht-myelinisierten Nerven sterben Durch ein Nährstoff Kanäle sterben. Einige Innervation Tritt Auch Durch epiphyseal und metaphysären foramina. Nervenbündel folgen Sie den Arteriolen mit Zweigen der Glatten Muskulatur der vessles Dienen oder gelegentlich in der hämatopoetischen Gewebe unter hämatopoetischen Zellen Endet.

Die hämatopoetischen Gewebe Besteht Aus einer vielzahl von Zelltypen, einschließlich Blutzellen und Derens Vorläufern, Adventitia / Sperrzellen, Adipozyten und Makrophagen. Die hämatopoetischen Gewebezellen Angebote sind nicht Zufällig angeordnet, Sondern Eine bestimmte Organisation Innerhalb des Gewebes (Weiss und Geduldig, 1991) (Abbildung 2) zeigen. Für Hämatopoese auftreten es von Einems Mikroumgebung Unterstützt Werden Muss das in der Lage ist hämatopoetische Stammzellen Erkennen und zu binden und sterben factors (z.B. Zytokinen) bereitzustellen, erforderlich Wir, äh sterben Proliferation, Differenzierung und Reifung von Stammzellen along begangen Abstammungslinien unterstützen. Die hämatopoetischen Mikroumgebung Besteht aus Adventitia retikulären Zellen (z.B. Sperrzellen), Endothelzellen, Makrophagen, Adipozyten, möglicherweise, Knochen Futter-Zellen (Osteoblasten z.B.) und Elemente der extrazellulären Matrix. Eine ausführlichere Beschreibung der Organisation und Funktion des hämatopoetischen Mikro Kann ein Anderer Stelle (; Hoffman et al 2000; … Gasper, 2000a 2000b 2000c; Abboud und Lichtman 2001 Weiss und Geduldig, 1991) gefunden.

Hämatopoese ist ein compartmentalized Prozess Innerhalb des hämatopoetischen Gewebes mit Erythropoese Platz in Verschiedenen anatomischen Einheiten (erythroblastischen Inseln) nehmen; Granulopoiese Tritt in less ausgeprägten Brennpunkte und Megakaryopoese Tritt ein Gesenk Sinusendothel nebeneinander. Nach Reifung, durchqueren sterben hämatopoetischen Zellen, Durch Barriere Zellen reguliert sterben, die Wand der venösen Sinus den Blutkreislauf zu gelangen; Thrombozyten Sind aus cytoplasmatischen von Megakaryozyten Eindringen Durch Die Sinuswand in den Sinus-Lumen direkt in das Blut freigesetzt. Einzelheiten des hämatopoetischen Prozess Kann ein Anderer Stelle zu FINDEN (Jain, 1986b; Hoffman et al 2000 ;. Gasper, 2000a 2000b 2000c; .. Abboud und Lichtman, 2001).

Die Produktion, Differenzierung und Reifung von Blutzellen Werden Durch humorale factors (Tabelle 2) geregelt. Einige factors (zum beispiel BPA / IL-3) wirken auf sterben primitiveren Zellen und Haben Eine allgemeine WIRKUNG, während andere (z Erythropoietin) zu handeln, später Vorläufern Einer bestimmten Zelllinie. Die Quellen hämatopoetischer factors variieren. Erythropoetin Wird produziert in erster Linie in der Niere MIT Mengen aus der Leber geringen und stimuliert sterben Proliferation von engagierten erythrozytische Vorläufern und sterben Freisetzung von unreifen roten Blutkörperchen; hohe Niveaustufen erhöhen geschwindigkeit der Differenzierung in Erythrozyten-Vorläufern sterben. Burst fördernde aktivität (BPA) Wird Durch T-Lymphozyten und Makrophagen produziert. IL-3 Wird Durch T-Lymphozyten und myeloiden Zellen produziert und Kann das same Makromolekül Wie BPA sein. Colony Simulieren factors Werden von Einer vielzahl von Zellen Erzeugt, einschließlich Makrophagen / Monozyten, Fibroblasten, Endothelzellen, Lymphozyten und Plazenta. Die Meisten Interleukine, B-Zellen-Wachstumsfaktor und B-Zellen-Differenzierungsfaktor aus T-Lymphozyten abgeleitet Sind. IL-1 Durch Makrophagen produziert. Hormone spielen Auch Eine physiologische Rolle (Jain, 1986c). Zum beispiel zirkulierenden Erythrozytenzahl erhöhen BZW. bei Weiblichen und Männlichen Ratten nach Gonaden zu entfernung verringern; Verwaltung der jeweiligen Geschlechtshormone, Auswirkungen von gonadectomy außer Kraft Gesetzt sterben. In addition Würde Knochenmark-Morphologie bei Weiblichen Ratten nach Ovariektomie Verändert (Benayahu et al. 2000). Hormone der Hypophyse, Nebennieren, der Schilddrüse und der Gonaden Erscheinen Durch veränderung Erythropoietinproduktion und erythroiden Vorläufer Reaktion auf andere factors (Jain, 1986c) in Erythropoese teilzunehmen. Zum beispiel, androgène, Thyroxin und Wachstumshormon-erhöhung sterben Produktion von Erythropoietin; Östrogen Hut Eine hemmende WIRKUNG Erythropoetin.

Examples von factors, sterben Hämatopoese zu stimulieren sterben.

Hämatopoetischen Gewebe is also empfindlich Gegenüber Äußeren Einflüssen und Kanns in Reaktion auf Diätetische Einschränkung, Unterernährung, chronische Entzündung, Toxizität und proliferativen oder neoplastischen Erkrankungen (Jain geworden unterdrückt, 1986d; Meierhenry, 1990; Wierda, 1990; Reagan, 1993; NTP 1999; NIEHS , 1999. 2001, Lund, 2000; Weiss, 2000). Bei der Ratte ist Ernährungszustand ein Wichtiger Faktor (Meierhenry, 1990). Zum beispiel Diät Einschränkung ausreichend bei jungen Ratten Gewichtszunahme zu stoppen verringerte Mark erythroide Elemente um 50%, myeloische Elemente um 40%, und Megakaryozyten um 20% (Brown, 1954). Vollständige Beschränkung für 7 Tage REDUZIERT Mark cellularity um 30% (Furman und Gordon, 1955). Levin et al. (1993). gezeigt that Eine starke (25% der Kontrolle) für 2 Wochen Diät Einschränkung in Einer relativen Erythrozytose, Lymphopenie, Thrombozytopenie und Knochenmark Nekrose resultiert. Und ist berichtet Worden that bei Ratten, Proteinaufnahme, Anstätt Gesamtkalorien, für Wartung der Erythropoese Wichtiger ist (Bethard et al. 1958) sterben.

Hämatopoese Ist ein kontinuierlicher Prozess, Sondern Kann in verschiedene Stufen (6) Getrennt Werden. Die erste Stufe Beinhaltet nicht gebundenen (pluripotenten) Stammzellen im Knochenmark Enthalten Sind. This pluripotenten Zellen Haben Zwei Hauptfunktionen. Erstens, sie behalten Ihre Zahlen Durch EINEN Prozess der Selbsterneuerung und zum Anderen Haben Sie sterben fähigkeit, Anstieg auf alle hämatopoetischen Zellen erhalten Wurde (Erythrozyten, Granulozyten, Lymphozyten, Monozyten und Blutplättchen). Sie Erscheinen Auch in Grosserer Anzahl peripher von der Mittelachse, in der Nähe der Knochenauskleidungszellen (Weiss und Geduldig, 1991; Picker und Siegelman, 1999; Gasper, 2000c) gefunden Werden.

Der grösste Teil des Verständnisses von hämatopoetischen Proliferation und Reifung Wurde unter verwendung bestrahlten abgeleitet Maus-Modell eines syngenen. Bestrahlte Mäuse infundiert mit Spenderzellen verursachen Herde in der Milz hämatopoetischen. In vivo Wurde gezeigt, sterben Dass Stammzellpools in der Ratte und der Maus konnten (Bis und McCulloch, 1961) gemessen Werden. Spender Mauszellen in Eine bestrahlte Maus Gebildet Knötchen in der Milz injiziert, sterben visuell gezählt Werden konnten. Es wurde gezeigt, that splenic Kolonien gerechnet wurden Klone (Becker et al. 1963) this, und ZVE Zellen in Diesen Kolonien der Selbsterneuerung und Differenzierung in den Hauptzelllinien sterben, sterben fähig Waren (Bis et al. 1964). This splenic Kolonien gerechnet wurden von Einer einzelnen pluripotenten Zelle stammend gezeigt, der Die koloniebildende Einheit-Milz (CFU-S) bezeichnet Wurde. Je nach Bedarf beeinflussen sterben Knochenmark-Mikroumgebung und Wachstumsfaktoren pluripotente Stammzellen zu unterscheiden begangen Stammzellen Entweder der myeloischen oder lymphatischen Serie (pluripotenten Stammzellen) oder der Zweiten Stufe der Hämatopoese. Sie haben Eine Begrenzte kapazität zur Selbsterneuerung, Aber das Potenzial HABEN, zu differenzieren und zu reifen Nachkommen Entwickeln. Myeloischen Stammzellen Sind multikoloniebildende Einheit für Granulozyten, Erythrozyten, Monozyten und Megakaryozyten (CFU-GEMM) sterben. Die dritte Stufe ist, WENN engagierte Stammzellen sterben von Verschiedenen Wachstumsfaktoren beeinflusst, in linienspezifische Vorläuferzellen differenzieren. Progenitorzellen im Knochenmark existieren für Megakaryozyten (CFU-Meg), Lymphozyten, Erythrozyten (BFU-E), Eosinophile (CFU-EOS) und Basophile (CFU-Baso). Es scheint, Neutrophilen und Monozyten Ergeben Sich Aus einem gemeinsamen Vorläufer (CFU-GM).

Lymphopoese erfolgt im Knochenmark-Mikroumgebung von erwachsenen Säugetieren (Allen und Dexter, 1984). Und B-Abstammungslinien-Zellen aus dem Knochenmark abgeleitet Sind, can Durch sequentielle Änderungen in der Zellgröße und der Expression von Immunglobulinketten identifiziert Werden. Große Prä-B-Zellen Sind frühe Vorläufer und Enthalten Schweren Ketten im Zytoplasma (Landreth und Kincade, 1984). Große prä-B-Zellen (

10-13 Mikron) teilen mindestens einmal kleiner (lt herzustellen; 9 mgr; m) pre-B-Zellen. Mit Gen-Umlagerung, die Kleinen reifen Prä-B-Lymphozyten in B-Zellen; sie drucken K and a leichte Ketten im Zytoplasma (Wierda, 1990). Die Sequenz der Proliferation / Reifung von B-Lymphopoese Wird Durch Lösliche factors reguliert sezerniert von Stromazellen (Picker und Siegelman, 1999) und ist empfindlich Gegenüber Störungen Durch myelotoxischen Chemikalien. Zum beispiel gerechnet wurden Polyhydroxyterminierte Metaboliten von Benzo (beispielsweise Hydrochinon) gezeigten B-Lymphopoese im Knochenmark verursacht Reifung Verhaftung der B-Zellen bei der Pre-B-Zellstadium beeinflussen (Wierda und Eisen, 1982; King et al 1988). . T-Zell-Lymphopoese Tritt in der Thymusdrüse, sterben Mit Knochenmark gewonnenen Stammzellen (Le Douarin et al. 1984) ausgesät Wurde. There is einige Hinweise darauf hinweist, that sterben Prothymozyten Eine Differenzierung Durchlaufen Haben und / oder verpflichtung Vor dem Thymus (Picker und Siegelman, 1999) zu verlagern. Morphologisch Haben die Ratte oder Maus Knochenmark nicht, noch Entwickeln, lymphatischen-Zellaggregate oder Strukturen Follikel Ahnelt, Auch nach der Immunisierung (Geldof et al. 1983). Ferner Kann, während das Knochenmark Eines geeigneten Mikroumgebung für einwandern antikörper-Produzierenden Zellen Zu haben Schien, Verteilt sterben Zellen in Einer zufälligen anordnung einzeln und anscheinend nicht auf Immunantwort Beiträgen sterben.

Methoden zur Bewertung des Knochenmarks

Bewertung des hämatopoetischen Systeme sollte EINEN mehrgleisigen Ansatz (das heißt peripheren Blut-Prüfung einschließlich Einer CBC und Differential, Knochenmarkausstrich Prüfung oder Gesamt Oberschenkels zählt und Auswertung von Zytozentrifuge Zubereitungen und / oder Knochenmark Histopathologie) durchgeführt Werden. Die Knochenmark Histopathologie und Prüfung der peripheren Blut Werden routinemäßig in der Toxizität und Sicherheit Bewertungsstudien durchgeführt. Zytologischen Präparationen can routinemäßig durchgeführt Werden, Aber Auswertungen Werden allgemein reserviert für Fälle, sterben in Denen hämatologischen Veränderungen identifiziert Werden und Bestimmung der Ursache benötigt.

Histopathologie is a Subjektive Einschätzung und ist Nützlich für die Bewertung Knochenmark-Architektur, beurteilung der Zellularität sterben, sterben Einschätzung der M: E-Verhältnis (Begrenzte empfindlichkeit), sterben beurteilung der Zelllinien, sterben Einschätzung der Eisenspeicher und andere Merkmale (zB Neoplasien, Entzündungen , Pigment, infektiöse Agenten). Marrow Abstrich Bewertungen und / oder Gesamt Oberschenkels was zählt quantitative ergebnisse and a bessere Zellmorphologie und sterben Determination of M: E-Verhältnisse und Reifung Indizes sterben. Während der following Eine kurze Übersicht ist, detailliertere Informationen und Techniken in BEZUG auf Histologische und zytologische beurteilung von Knochenmark gerechnet wurden beschrieben (Lewis und Rebar, 1979; Cline und Maronpot 1985; Grindem 1989 Tyler und Cowell, 1989; Wickramasinghe 1992; Buckley, 1995 ; Andrews, 1998; Auto und Blau, 2000; Freeman, 2000; Lanning, 2001; Valli et al 2002) ..

If Biopsien Kernmark bei erwachsenen Hunden durchgeführt Wird, ist es in der Regel erforderlich Wir sterben Proben aus dem Beckenkamm zu nehmen, Brustbein, proximalen Humerus, Fossa trochanterica des Oberschenkels oder Einer Rippe, Wie zentrale Oberschenkelmarkhöhle schnell Vollständig Durch Fett Ersetzt Werden Kann sterben. In der Ratte und der Höheren Maus jedoch der Umsatz von Erythrozyten aufgrund Einer kürzeren zirkulierende lebensdauer means that der Markraum in den Meisten Knochen für das Leben besiedelten bleibt. Und in DEM Nagetier, Scheint es, that the Brustbein und Rippen und wahrscheinlich Humerus und proximalen Femur Sind Wichtige Messstellen, Wie das Markieren Sie einen Diesen Stellen hämatopoetisch aktiv bleibt, unabhängig vom Alter des Tieres. Beispielsweise in der Fischer Ratten von 4 monaten bis 2 Jahren, das Brustbein, Rippen, Humerus und proximalen Femur had Eine Relativ- Ähnliche Mark Zellularität von ETWA 68% (Cline und Maronpot, 1985). Der distale Femur und proximale Tibia Waren ähnlich bei ETWA 61% Mark Zellularität. Unabhängig von Alter, had sterben distale Tibia EINEN spürbaren Mangel ein AktiVen Hämatopoese.

Es wird allgemein Angenommen that in dem Hund, Normalen Knochenmark ETWA 50% Fett und 50% hämatopoetischen Gewebe Enthält; 70 ETWA bis 80% des hämatopoetischen Gewebes in Ratten und Mausen (Valli et al. 2002) zu sein Mark. Beim Hund Kann jedoch Mark Zellularität von 20% bis 80% des Markraum reichen, je nach Standort und Alter (Weiss, 1986; Valli et al 2002). (Abbildung 7). In Einer Studie zur Bewertung Fischer Ratten, abhängig von dem Alter und DM anatomischen Ort, der Raum Durchschnittliche Mark von hämatopoetischen Zellen 33-88% Variiert besetzt (Cline und Maronpot, 1985). In of this sterben Studie Hatten Jüngsten Tiere Höchste Mark Zellularität sterben. Beispielsweise unabhängig von Ort, Krieg sterben mittlere Mark Zellularität

80% bei 2 Monate alt; von 2 jahren sank der Zellularität Auf einen Mittelwert von

66%. Examples von Normalen Ratten und Maus-Knochenmark Sind in den 8 und 9 gezeigt.

Low (A) und Höher (B) Vergrßerung des femoralen Mark von Einer Normalen jungen erwachsenen Hund. Mikroskopische Aufnahme Mit freundlicher genehmigung von Drs. Hans Harleman und Kathryn Bowenkamp.

Für Histopathologie Infos finden zahlreiche Variablen in BEZUG auf Probenentnahme und Verarbeitung (z Fixierungen, Entkalkung, Einbettung, Schneiden und Färben) beeinflussen Qualität der Probe ausgewertet Werden und Müssen berücksichtigt Werden sterben. Für Eine Ausführliche Diskussion, Wird der Leser auf Referenzen in BEZUG auf Verarbeitungsverfahren (Bennett et al bezeichnet 1976 Beckstead et al 1981 ;. Moosavi et al 1981 ;. Weiss, 1987; Wickramasinghe, 1992; Callis und Sterchi, 1998; Hedrich und Bullock , 2004; Fero, 2005). Eine kurze Beschreibung folgt.

Fixierungen

If bei der Nekropsie gesammelt, sollte Mark so kahl wie möglich mind for the Histologische beurteilung gesammelt Werden. Fixative Lösungen stabilisieren Gewebe Durch Vernetzung Proteine ​​und der Grad der Vernetzung in der Denaturierung der Proteine ​​und Führen morphologischen, cytochemischen oder immunhistochemische Eigenschaften der Probe beeinflussen. Weil seine leicht verfügbar, 10% neutral gepuffertem Formalin (10% NBF) ist das am häufigsten Verwendete Fixiermittel. Für Routine H&E abschnitte ist keine besondere Handhabung erforderlich Wir, vor der Gewebeverarbeitung. 10% NBF-fixierten Gewebe can für Gefrierschnitten und Auswertung von Adipozyten used Werden. Bei Proben für sterben Immunhistochemie, Eine Verlängerte Fixierung in 10% NBF used Werden, can nachteilig (aufgrund der fortgesetzten Aminogruppe vernetzende und veränderung von tertiären Proteinstruktur beispielsweise Verlust der antigenen Epitope) sein. Übertragen des Gewebes auf 70% Ethanol nach Einer 12-stündigen Fixierungen REDUZIERT Effekte Fixationsbezogen.

Zenkers-Typ-Lösungen (zum beispiel Zenkers-Essigsäure, B5, Helly ist) Sind ein Häufig empfohlen, Aber im Allgemeinen nicht für Fixiermittel Knochenmarkschnitte used. This Fixierungen Müssen frisch vor gemacht Werden, zu Verwenden und Gewebe Müssen vor der Verarbeitung oder Behandelt mit Lugolsche Lösung gewaschen Werden Pigmente zu entfernen. Die Gewebe Werden in 1-2 Stunden ausreichend Fixiert, Aber Dann zu Alkohol übertragen Werden Müssen; Werden Gewebe hart und spröde mit Längerer Fixierungen. Feine Ausscheidungen can im Gewebe und Bilden Kann problematisch Werden, WENN besondere Flecken angewendet Werden (zum beispiel Silberflecken). Daruber Hinaus ist das Fixiermittel bestandteil Merkurichlorid toxisch und leicht Durch Die Haut aufgenommen. There is Zinkchloridbasis, Zenkers artigen fix-senschaften (z AZF); This Haben Ähnliche Eigenschaften Wie Zenkers Flüssigkeiten, Aber keine Quecksilberchlorid. Zenkers-Typ Fixierer Sind für immunhistochemischen Elle Verfahren Nützlich. Und sie wirken als Beizmittel für sterben Giemsa zu Einer verbesserten Kern Detail war.

Bouin-Lösung die ist bevorzugte Fixiermittel von Einigen Forschern für Knochenmarkabschnitte. Gewebe Werden Durch Eine 2 bis 4 Stunden nach dem Waschen Fixierungen (in Wasser) und der Lagerung in 70% Ethanol über Nacht, gefolgt Fixiert. Die Gewebe Werden hart und spröde mit Längerer Fixierungen. Die Pikrinsäure konstituierenden Flecken Gewebe gelb. Da Bouin-Essigsäure Enthält, Kann es zur Entkalkung used Werden; stirbt Kann Eine Längere Zeit in anspruch nehmen und erfordert Häufige (Wöchentlich) Lösung Andert. Empfindliche morphologischen Details ist nicht gut erhalten, Aber es Wirkt als Beizmittel für Basische Anilinfarbstoffe (z.B. H&E) sterben Aufgabe Verbesserung der Färbung.

Entkalkung

Für in Paraffin eingebetteten Schnitten, Proben Knochenmark Einander Vor dem Schneiden entkalkt Werden; Proben für sterben Kunststoff-Einbettung nicht. There is zahlreiche ArTeN von Entkalker (z.B. Sauren, Chelatbildnern, Harze) und Methoden (z.B. Eintauchen, Beschallung, Mikrowellen, Ionenaustausch) zur Entkalkung von Knochenmarksproben. If Erhaltung der Enzymreaktionsfähigkeit oder antigen Stellen ist erforderlich Wir sterben, Auswahl des Verfahrens der Entkalkung ist wichtig sterben. Bei größeren Proben einige Schaden ein Gewebemorphologie Durch Entkalkung, ist schnell unvermeidlich (insbesondere bei der verwendung von Säure Entkalker).

Sowohl organic Als Auch Mineralsäuren Sind für Entkalkung von Knochenmarkproben used sterben. Organische Sauren (zum beispiel Ameisensäure und Essigsäure) entkalken Langsamer als Mineralsäuren (z HCL und Salpetersäure). Mineralsäuren Sind in den S-Typ Entkalkung Methoden used. Overdecalcification von Gewebe mit Sauren, insbesondere Mineralsäuren, Führt zu Gewebezerstörung. So Gewebe in Säure Entkalker sollte nicht für langere Zeit deaktiviert bleiben (z über ein Wochenende). Für sterben richtige Entkalkung, Muss es Eine gleichmäßige verteilung der Säure um Knochenprobe sein. So Gewebesuspension oder sanfter Bewegung, Wie sanftes Mischen (z Schüttler / Wippe) oder Luftblase Versickerung, Kann sein Nützlich. In addition Kann Säure Entkalker benötigen Häufige Lösung Änderungen (zum beispiel Täglich) für Eine angemessene entkalken. Im Allgemeinen Wird Säure Entkalkung nicht für Proben, sterben für enzym- oder Immunofärbung empfohlen sterben. This Einschränkung ist BESONDERS geeignet für sterben Mineralsäuren Wie HCl oder Salpetersäure; sterben organischen Sauren Erscheinen etwas besser sein. Alle Säure Entkalker, insbesondere Mineralsäuren, reduzieren Morphologische Qualität und Giemsa Flecken nicht akzeptabel sein Kann, Durch den VERLUST von basophilen-Färbung Strukturen.

Chelatisierende Mittel, Wie EDTA, Sind Auch Häufig zur Entkalkung von Knochenmark-Proben used. Entkalkung bei schreitet Einer langsameren Rate zu den Säure Entkalker verglichen, insbesondere im Vergleich zu Mineralsäuren. EDTA Entkalkung Wird für Enzym- und Immunfärbungsverfahren empfohlen. Die WIRKUNG von EDTA pH-abhängig ist (D. H. je Höher der pH-Wert, Desto schneller sterben Entkalkung). Da ein hochalkalischen pH Auch Gewebezerstörung und resultierenden VERLUST von zytologischen, Enzym oder Qualitäten Immunofärbung jedoch dazu Führen Können, ist verwendung von EDTA bei Einems Hohen pH-Wert (z.B. pH 10) zu vermeiden sterben. Mit anfänglichen Platzierung von Gewebe in Einer ausreichenden Menge Chelator Wird Lösung Ersatz in der Regel nicht benötigt.

This Entkalker can einzeln oder in Kombination unter verwendung von Eintauchen, Mikrowelle, Ultraschall oder elektrolytisches Elle Verfahren angewendet Werden. Für Tauchtechniken Werden Gewebe in ausreichender Entkalker bei Umgebungstemperatur gegeben sterben. Das ist langsamste der sterben vorgenannten Elle Verfahren verursacht jedoch den geringsten Schaden artifactual Gewebe, Wenn Die Probe overdecalcified und H&E-Färbung ist in der Regel ausreichend. Mikrowellentechniken Nutzen Eine Mikrowelle ein Wasserbad zu erhitzen, in DM ein Behälter mit Tauch Gewebe in Einems Entkalker angeordnet ist.

Entkalkung Wird (vor Allem mit den Mineralsäuren) verbessert, Aber es ist leicht, um das Gewebe zu Hitzebeschädigungs (vor Allem bei gt; 45 ° C). Mit 70% Leistung Amt für 20 Minuten mit 10 Minuten Abkühlzeit Intervalle helfen, Auswirkungen von Hitze verringern sterben. H&E-Färbung ist in der Regel ausreichend, Aber man Kann dunkle Mark Komponenten mit Geringer Dichte, verschmiert Kerne (wahrscheinlich im zusammenhang MIT SCHADEN ein Wärme) zu Sehen. Beschallen Techniken beinhalten das Eintauchen der Gewebe in Einems Beschallungsgerät Enthält Entkalker und beschallen der Gewebe. Die geschwindigkeit der Entkalkung verbessert und H&E-Färbung ausreichend ist, Aber es Kann zu zytologischen Veränderungen ähnlich sein, Geschieht wurde, um Mikrowellenverfahren sterben. Das elektrolytische Elle Verfahren Beinhaltet in Einer Säure Entkalker Zwischen zwei elektroden und Leiten Eines Schwachen elektrischen Strom ein einzelnes Gewebe Aussetzung Entkalkungszeit zu verbessern. Of this Elle Verfahren ist etwas schneller als Tauch- und sterben Färbung ist auf das Eintauchverfahren Vergleichbar. Allerdings ist aufwendig und Einrichtung nicht zugänglich Einems Hochdurchsatz-Betrieb sterben; stirbt erfordert Eine Häufige Lösung Veränderungen und Hitzeschäden auftreten Können.

Entkalkung Durch Ionenaustausch ist von den obigen Elle Verfahren in that ein Calcium-Sequestriermittel Harz Wird in Kombination mit Einer Säure Entkalkungsmittel used. This Technik Scheint schneller als Tauchverfahren zu sein und Scheint Die beste Morphologie für Gewebe mit H gefärbt zu liefern&E. Ein Harz (z.B. Win-3000) in DEM Boden Eines Behälters angeordnet, Dann mit Einer der Säure Entkalker (typischerweise Einer organischen Säure, Wie Ameisensäure) gefüllt ist; das Gewebe (n) in der Entkalker eingetaucht. Da das Harz sterben Kalzium sequestriert, Kann keine chemische Fällungsverfahren zur Bestimmung der Entmineralisierung Endpunkt durchgeführt Werden. Das Harz Kann wiederverwendet und tägliche Lösung Änderungen Werden unnötig. Jedoch ist of this Elle Verfahren nicht zugänglich Hohen Durchsatzoperationen aufgrund der Verfügbarkeit und der Kosten des Harzes, kapazität Begrenzt Gewebe in der Entkalkung Kammer und der für gründliches Waschen des Harzes erforderliche Zeit zur Wiederverwendung.

Entmineralisierung Determination

Bestimmung der Entmineralisierung Endpunkt ist ein Wichtiger schritt. Overdecalcification ergebnisse in Gewebezerstörung und underdecalcification Führt zu Einer Schlechten Dehydrierung und Infiltrations und schließlich Schnitte. Das Röntgenverfahren ist das genaueste, Aber erfordert geeignete Ausrüstung sterben. Auch Behandelte Gewebe mit Fixiermitteln Quecksilber oder andere Schwermetalle Enthalten, Werden wiedergegeben strahlenundurchlässigen; SOMIT Röntgens can not für this Gewebe used Werden. Die chemische Fällungsverfahren (zum beispiel Calcium-Oxalat-Fällung) ist zuverlässig und einfach für Säure-Entkalker angewendet. Eine Abwandlung of this Verfahrens Kann Auch für EDTA entkalkt Geweben used Werden. Mechanische Biegen oder sondieren is a Subjektive Einschätzung und ist mit Abstand einfachste Methode sterben, und Wird oft Getan. Aber es ist nicht zu empfehlen, da es nicht zuverlässig, und sterben Gewebemanipulation ist Architektur stören Können oder Weichgewebekomponenten aus der Probe entfernen. Probe SCHNEIDEN is also used Worden und Scheint Eine akzeptierte Praxis sterben.

Gewebeverarbeitung und Färbung

Wegen Wadenfänger Routine zu Verwenden, H&E-gefärbten Schnitten von in Paraffin Eingebettet Sind Knochenmarkgewebe histologisch typischerweise ausgewertet. Jedoch H&E Stellt keine konsistente hämatopoetischen Zelldifferenzierung. Die Schnittdicke ist ein Wichtiger Faktor und 3-Mikron-abschnitte besser zellulären morphologischen Details Bieten im Vergleich zu dickeren (≥5-Mikron) abschnitte (Abbildung 18). Die zytologische Qualität ist jedoch nicht so gut, im Vergleich zu Romanowsky befleckten zytologische Präparate. Giemsa-gefärbten Schnitten bietet Eine bessere morphologische Details im Vergleich zu H&E-gefärbten Schnitten und Sind leichter im Vergleich zu Romanowsky-gefärbte Präparate.

Vergleich von Details von zytomorphologische Merkmale between Einems 5-Mikron (A) und Einems 3-Mikron-Abschnitt (B) gefärbt mit Hämatoxylin & Eosin. Femoral Mark von Normalen B6C3F1-Mausen.

Für sterben Giemsa jedoch säure entkalkt Gewebe Führt zu Einems VERLUST von basophilen-Färbung Strukturen. Die verwendung von Chelat-Typ Entkalker verbessert Giemsa. Kunststoff-Einbettung Eine signifikante Aufgabe Verbesserung in der Zellmorphologie. In addition is also zur Entkalkung keine notwendigkeit, DAMIT Schrumpfungs Artefakt zu reduzieren und den Verlust der Zelldetail Entkalkung Methoden verwandt. Dünne Schnitte (≤3 Mikron) can leicht Hergestellt Werden, zytologische Qualität zu verbessern. Jedoch ist Kunststoff Einbettungszeit, Arbeits- und kostenintensiv und SOMIT nicht gerechtfertigt für ein Hochdurchsatz-Betrieb. Preußisch Blau-Färbung ist für sterben beurteilung der Eisenspeicher used Wird; Sauren in Entkalker oder Fixierungen can Eisenspeicher Auswaschung. So Gewebe Eisen unterschätzt Werden Könnte.

Zusammenfassung

Da das hämatopoetische System-ein potenzielles Zielorgan der Chemischen Exposition ist, sterben Bewertung des Blutes und des Knochenmarks ist wichtiger bestandteil Jeder Toxizität oder Sicherheitsbeurteilung Studie. Bewertung des hämatopoetischen Systeme sollte routinemäßig Eine CBC und Differentielle und Knochenmark Histopathologie umfassen. Während sterben CBC im peripheren Blut Nachgewiesen Informationen bezüglich möglicher substanzbedingte Effekte liefert, liefert Morphologische beurteilung von Knochenmark Informationen über Markgewebearchitektur Knochen (zB Zellularität, Zelle linages, vaskuläre oder Stroma Veränderungen, Entzündungen, Nekrose), sterben Einschätzung der Eisenspeicher und IDENTIFIZIERUNG von weiteren Funktionen ( zB Pigment, infektiöse Agenzien, proliferativen oder Tumorerkrankungen), sterben ansonsten Würde allein Durch Untersuchung der peripheren Blut fehlen sterben. Die Qualität der Markabschnitte ist jedoch von zahlreichen Variablen in BEZUG auf Probensammlung und Verarbeitung Bestimmt und berücksichtigt Werden Müssen sterben.

Anerkennungen

This Forschung Wurde von der Intramural Research Program des NIH, National Institute of Environmental Health Sciences Unterstützt.

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